Вплив збудників захворювань вірусної етіології на реплікативну активність віл у хворих на віл-інфекцію

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

БАБІЙ НАТАЛІЯ ОЛЕКСАНДРІВНА

УДК 616 (9.578.27:36-002+98:578.828):616-036

ВПЛИВ ЗБУДНИКІВ ЗАХВОРЮВАНЬ ВІРУСНОЇ

ЕТІОЛОГІЇ НА РЕПЛІКАТИВНУ АКТИВНІСТЬ ВІЛ У ХВОРИХ НА ВІЛ-ІНФЕКЦІЮ

03.00.06 – вірусологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в ДУ „Інститут епідеміології та інфекційних хвороб

ім. Л.В.Громашевського АМН України”

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор,

заслужений діяч науки і техніки України

Щербінська Алла Михайлівна

ДУ „Інститут епідеміології та інфекційних хвороб

ім. Л.В.Громашевського АМН України”, провідний науковий співробітник лабораторії загальної вірусології

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Карпов Олександр Вікторович, Національний університет харчових технологій МОН України, професор кафедри біотехнології мікробного синтезу

доктор медичних наук, професор Дзюблик Ірина Володимирівна, Національна медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України, завідувач кафедри вірусології

Захист дисертації відбудеться 22 квітня 2008 р. о 16 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 при Київському національному університеті імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, м.Київ, пр-т Глушкова 2, корпус 12, аудиторія 434.

Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченко за адресою: Україна, 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий 18 березня 2008р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради О.В.Молчанець

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На сьогоднішній день за темпами поширення ВІЛ-інфекції Україна посідає одне з провідних місць в Європі. Станом на 1.01.08 р. в Україні офіційно зареєстровано 81,7 тис. ВІЛ-інфікованих осіб (Інформ. бюлетень, 2008). Перші випадки ВІЛ-інфекції в Україні були зафіксовані в 1987 році. До 1995 року поширення ВІЛ-інфекції мало повільний, спорадичний характер з домінуванням статевого, переважно гетеросексуального, шляху передачі збудника хвороби. З 1995 року, внаслідок розповсюдження ВІЛ серед споживачів ін’єкційних наркотиків, кількість ВІЛ-інфікованих осіб почала зростати в геометричній прогресії (Щербинская А.М. и соавт., 2003; Люльчук М.Г., 2005).

З поглибленням імунної недостатності у хворих на ВІЛ-інфекцію розвиваються опортуністичні інфекції, зокрема вірусної етіології, та інші захворювання інфекційної і неінфекційної природи, які стають основною причиною смерті ВІЛ-інфікованих осіб. Особливе місце серед них займають герпесвірусні інфекції, оскільки герпесвіруси мають значний рівень поширеності серед населення і виражену здатність до персистенції. Гепатити В і С, які часто зустрічаються у ВІЛ-інфікованих осіб у зв’язку з наявністю спільних шляхів передачі збудників наведених інфекцій, також здатні впливати на перебіг та завершення ВІЛ-інфекції. Це зумовлює актуальність і необхідність визначення механізмів та прогнозування наслідків взаємного впливу збудників захворювань вірусної етіології та ВІЛ в умовах коінфекції. (Monga H.K., 2001; Konopnicki D., 2005).

В ряді науково-дослідних робіт було виявлено, що збудники вірусних опортуністичних хвороб та віруси гепатитів В (ВГВ) і С (ВГС) можуть впливати на активність реплікації ВІЛ, прогресування ВІЛ-інфекції та ефективність антиретровірусної (АРВ) терапії (Griffiths P.D., 1998; Sulkowski M.S., 2002; Den Brinker M., 2000; Schacker T., 2002; Carlos M. J., 2004; Celum C.L., 2005). Однак, незважаючи на актуальність та активне вивчення цієї проблеми, єдиного погляду на неї не існує. Літературні дані, що стосуються цього питання, часто носять суперечливий характер. Проте, слід зазначити, що в Україні ця проблема є особливо актуальною у зв’язку із значним зростанням кількості споживачів ін’єкційних наркотиків.

Моніторинг за активацією збудників персистентних опортуністичних інфекцій у ВІЛ-інфікованих та хворих на СНІД, розуміння механізмів та наслідків взаємодії збудників вірусних коінфекцій та вірусу імунодефіциту людини є необхідними для прогнозування перебігу ВІЛ-інфекції, визначення оптимальної стратегії лікування таких хворих.

Наведене обумовлює необхідність ретельного дослідження спектру вірусних коінфекцій у ВІЛ-позитивних осіб в залежності від шляху інфікування ВІЛ, вивчення зв’язку між активною реплікацією збудників вірусних інфекцій та рівнем реплікативної активності ВІЛ-1.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційні дослідження були проведені в рамках планових науково-дослідних робіт лабораторії загальної вірусології Державної установи (ДУ) «Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В.Громашевського АМН України»: «Визначення факторів, що обумовлюють особливості перебігу ВІЛ-інфекції/СНІДу в Україні» (державний реєстраційний № 0101V002328), «Вивчення молекулярно-біологічних властивостей популяції ВІЛ, що циркулює в Україні» (державний реєстраційний № 0104U000125) та «Розробка алгоритму моніторингу за активацією збудників персистентних інфекцій у ВІЛ-інфікованих та хворих на СНІД» (державний реєстраційний № 0106U000022). Науково-дослідні роботи виконувались в межах „Національної програми забезпечення профілактики ВІЛ-інфекції, допомоги та лікування ВІЛ-інфікованих і хворих на СНІД”.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи буловивчення зв’язку між активацією збудників вірусних коінфекцій, рівнем реплікативної активності ВІЛ та показниками імуносупресії у осіб, хворих на ВІЛ-інфекцію/СНІД.

Для досягнення вказаної мети були поставлені такі завдання:

Встановити частоту виявлення серологічних маркерів герпесвірусних інфекцій у ВІЛ-інфікованих осіб.

Визначити частоту виявлення серологічних маркерів інфікування ВГС та ВГВ та показників активної реплікації цих вірусів у ВІЛ-інфікованих осіб.

Встановити генотипову структуру та рівень реплікативної активності ВГС у ВІЛ-інфікованих осіб в залежності від стадії ВІЛ-інфекції.

Дослідити зв'язок між показниками активної реплікації ВІЛ-1, рівня CD4 лімфоцитів та наявністю маркерів активації збудників герпесвірусних коінфекцій.

Вивчити зв'язок між показниками рівня вірусного навантаження ВІЛ, кількості CD4 лімфоцитів та вмісту РНК ВГС в плазмі крові ВІЛ/ВГС-коінфікованих осіб.

Об’єкт дослідження. Реплікативна активність ВІЛ-1 відповідно до стадії ВІЛ-інфекції; частота виявлення серологічних маркерів інфекцій вірусної природи; частота виявлення молекулярно-біологічних показників активної реплікації вірусів; рівень вірусного навантаження ВІЛ-1; кількість CD4 лімфоцитів.

Предмет дослідження. Зразки сироватки та плазми крові ВІЛ-інфікованих осіб; історії хвороб ВІЛ-інфікованих пацієнтів; серологічні маркери вірусних інфекцій; РНК ВГС та ДНК ВГВ; рівень вмісту РНК ВІЛ-1; рівень вмісту РНК ВГС; шляхи передачі інфекцій.

Методи досліджень. Для виконання поставлених завдань у роботі використано комплекс вірусологічних, серологічних, молекулярно-генетичних методів та методів статистичної обробки результатів.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше в Україні вивчено частоту активації збудників персистентних вірусних коінфекцій у хворих на ВІЛ-інфекцію/СНІД в залежності від стадії ВІЛ-інфекції, шляху інфікування ВІЛ та прийому АРВ-препаратів. Показано, що у переважної більшості ВІЛ-інфікованих осіб, у яких були виявлені серологічні маркери гепатиту С, не залежно від клінічної стадії ВІЛ-інфекції та отримання ВААРТ, в плазмі крові визначалася ВГС-специфічна РНК, що свідчило про активну реплікацію вірусу. Встановлено, що в плазмі крові більшості ВІЛ-інфікованих осіб, які мали серологічні маркери ВГВ-інфекції, молекулярно-біологічні показники активної реплікації ВГВ (ДНК ВГВ) були відсутні.

На підставі аналізу частоти виявлення генетичних варіантів ВГС встановлено домінування субтипів 1в та 3а у ВІЛ/ВГС-коінфікованих осіб не залежно від шляху інфікування ВІЛ-1 та вищий рівень поширеності генотипу 1а ВГС серед осіб, інфікованих ВІЛ статевим шляхом.

Вперше в Україні проведено дослідження рівня реплікативної активності ВГС у пацієнтів з коінфекцією ВІЛ/ВГС і встановлено, що у осіб, які отримували ВААРТ, середній рівень вірусного навантаження ВГС був достовірно вищий, ніж у осіб, які не приймали цієї терапії.

Вперше в Україні встановлено, що у пацієнтів, які не отримували ВААРТ, між показниками вірусного навантаження ВІЛ та ВГС існує позитивний кореляційний зв'язок, а між рівнем вмісту РНК ВГС та кількістю CD4 лімфоцитів – зворотний кореляційний зв'язок.

Показано, що активація збудників герпесвірусних інфекцій у ВІЛ-інфікованих осіб відбувалася на тлі вираженої імуносупресії та супроводжувалася достовірно вищими показниками рівня вірусного навантаження ВІЛ-1, порівняно з групою осіб, у яких не було виявлено маркерів активації цих інфекцій.

Практичне значення отриманих результатів. Обґрунтовано необхідність систематичного спостереження за перебігом гепатиту С та проведення лікувальних заходів для запобігання прогресуванню цього захворювання у осіб з коінфекцією ВІЛ/ВГС. Визначено важливість встановлення субтипової приналежності ВГС у інфікованих осіб для вибору ефективної схеми терапії гепатиту С. Обґрунтовано необхідність проведення постійного ретельного контролю за рівнем вмісту РНК ВІЛ та ВГС у осіб з коінфекцією ВІЛ/ВГС, які отримують ВААРТ, особливо у тих пацієнтів, для яких терапія виявилася неефективною.

Отримані результати впроваджено в роботу Українського центру профілактики та боротьби зі СНІД МОЗ України.

Результати проведених досліджень враховано при розробці Методичних рекомендацій щодо лабораторного моніторингу за ВІЛ-інфекцією та антиретровірусною терапією, які готуються до видання в 2008 році.

Особистий внесок автора. Основну частину експериментального матеріалу, викладеного в дисертації, отримано автором самостійно. Це стосується даних щодо частоти виявлення серологічних маркерів гепатитів В і С та інфекцій, викликаних вірусами простого герпесу 1 і 2 типів (ВПГ1/2), цитомегаловірусом (ЦМВ), вірусом Епштейна-Барр (ВЕБ) у ВІЛ-інфікованих осіб; наявності показників активної реплікації ВГС та ВГВ в крові пацієнтів, хворих на ВІЛ-інфекцію/СНІД; рівня вірусного навантаження ВГС в зразках плазми крові ВІЛ-інфікованих пацієнтів. Дисертантом особисто проведено кореляційний аналіз для кількісної оцінки зв'язку між рівнем вмісту РНК ВГС в плазмі крові коінфікованих осіб та показниками реплікативної активності ВІЛ.

Визначення вірусного навантаження ВІЛ-1 у зразках плазми крові інфікованих осіб проводилося спільно зі старшим науковим співробітником лабораторії загальної вірусології ДУ «Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім.Л.В.Громашевського АМН України» к.м.н. Люльчук М.Г., яка є співавтором публікацій автора. Самостійно проведено аналіз та узагальнення отриманих даних, здійснено статистичну обробку результатів.

Автором проведено аналіз наукової літератури з досліджуваної теми, здійснено інформаційно-патентний пошук, визначено та обґрунтовано напрямок досліджень. Формулювання мети та основних положень і висновків, підготовку публікацій за результатами досліджень, представлення їх на наукових конференціях здійснено спільно з науковим керівником д.м.н., проф. Щербінською А.М.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень оприлюднені на наступних наукових конференціях: ІІІ міжнародній конференції „Біоресурси та віруси” (11 – 15 вересня 2001 року, м. Київ); науково-практичній конференції „Герпесвірусні інфекції – клініка, лікування, діагностика” (м. Київ, 15 – 16 жовтня 2002 року); науково-практичній конференції пленуму Асоціації інфекціоністів України „Вірусні хвороби. Токсоплазмоз. Хламідіоз” (м. Тернопіль, 5 – 6 травня 2004 року); першій конференції з питань ВІЛ/СНІД в Східній Європі і Центральній Азії (м.Москва, 15 – 17 травня 2006 року); науково-практичній конференції „Епідеміологія, сучасні методи діагностики та профілактики гострих інфекцій дихальних шляхів” (м. Київ, 7 – 8 лютого 2007 року); V міжнародній конференції „Біоресурси та віруси” (м. Київ, 10-13 вересня 2007 року); IV Всеросійській науково-практичній конференції «Генодиагностика инфекционных болезней – 2007» (м. Москва, 28 – 30 листопада).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 15 робіт, в тому числі 4 статті в наукових фахових виданнях, рекомендованих ВАК України.

Структура та обсяг дисертації. Зміст роботи викладено на 148 сторінках. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, трьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів, висновків, списку використаних джерел з 226 найменувань. Робота містить 5 таблиць та 19 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Представлено сучасні дані щодо історії виникнення та відкриття вірусу імунодефіциту людини, розглянуто структурну характеристику ВІЛ та збудників вірусних інфекцій, які поширені серед хворих на ВІЛ-інфекцію/СНІД. Проаналізовано літературні дані, присвячені дослідженню проблеми взаємовпливу збудників вірусних захворювань та ВІЛ в умовах коінфекції, охарактеризовано сучасний стан проблеми.

Матеріали та методи досліджень. В дослідження було включено 425 ВІЛ-інфікованих осіб, які перебували на диспансерному обліку у відділенні СНІДу клініки ДУ „Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім.Л.В. Громашевського АМН України”. ВІЛ-інфіковані пацієнти були розподілені на три групи: І група – пацієнти, які за класифікацією ВООЗ знаходились в І клінічній стадії ВІЛ-інфекції (стадія безсимптомного вірусоносійства) (75 осіб); ІІ група – пацієнти в ІІІ клінічній стадії ВІЛ-інфекції, які мали клінічні ознаки ВІЛ-інфекції, але поки що не отримували високоактивну антиретровірусну терапію (ВААРТ) (50 осіб); ІІІ група – ВІЛ-інфіковані пацієнти в ІІІ чи ІV стадії ВІЛ-інфекції, які отримували ВААРТ протягом не менше 6 місяців (300 осіб). Формування груп дослідження було проведено на основі аналізу даних щодо віку ВІЛ-інфікованих осіб, шляху інфікування ВІЛ-1, кількості CD4 лімфоцитів в крові, дати початку та схеми ВААРТ, отриманих з історій хвороб.

Наявність інфекцій вірусної етіології у ВІЛ-інфікованих осіб визначали шляхом виявлення серологічних маркерів інфікування герпесвірусами (вірусами простого герпесу 1 і 2 типів, цитомегаловірусом, вірусом Епштейна-Барр) та вірусами гепатитів В і С в зразках сироватки крові цих пацієнтів. В досліджуваних зразках виявляли антитіла класу IgG до ВПГ1/2, ЦМВ, ВЕБ, ВГС, HBsAg ВГВ та сумарні антитіла IgG+IgM до ВГВ.

Для встановлення активації збудників захворювань вірусного генезу методом ІФА визначали наявність антитіл класу IgM до герпесвірусів у зразках сироватки крові 425 ВІЛ-інфікованих осіб, методом ПЛР досліджували зразки плазми крові пацієнтів, у яких були виявлені серологічні маркери інфікування ВГС та ВГВ, на наявність РНК ВГС (досліджено 135 зразків) та ДНК ВГВ (досліджено 125 зразків). Протестовано 115 зразків крові ВІЛ-інфікованих осіб для визначення генотипу ВГС.

З метою встановлення зв’язку між активацією збудників захворювань вірусної етіології, рівнем реплікативної активності ВІЛ-1 та показниками імуносупресії у ВІЛ-інфікованих осіб в 125 зразках плазми крові, отриманих від ВІЛ-інфікованих осіб в різних клінічних стадіях ВІЛ-інфекції, методом ПЛР встановлено рівень вірусного навантаження ВІЛ-1 та проаналізовано отримані дані в залежності від наявності маркерів активації збудників захворювань вірусної етіології, рівня вмісту СD4 лімфоцитів та клінічної стадії ВІЛ-інфекції.

Методом ПЛР визначено рівень вірусного навантаження ВГС у 34 ВІЛ/ВГС-коінфікованих осіб. За допомогою методу кореляційного аналізу проведено кількісну оцінку зв’язку між показниками рівня вірусного навантаження ВІЛ, кількості CD4 лімфоцитів та вмісту РНК ВГС в плазмі крові ВІЛ/ВГС-коінфікованих осіб.

Статистичну обробку отриманих даних здійснювали з використанням комп’ютерної програми Microsoft Excel-2000.

Поширення герпесвірусних інфекцій серед ВІЛ-інфікованих осіб. Аналіз результатів дослідження поширення герпесвірусних інфекцій серед ВІЛ-інфікованих осіб виявив, що більше 90% досліджених зразків крові, отриманих від ВІЛ-інфікованих осіб, містили антитіла класу IgG до герпесвірусів. Так, IgG до ВПГ1/2 було виявлено у 74,67±5,02% осіб в І клінічній стадії ВІЛ-інфекції (І група), у 76,0±6,04 осіб в ІІІ клінічній стадії ВІЛ-інфекції (ІІ група) та 75,67±2,48% осіб в ІІІ-ІV клінічних стадіях ВІЛ-інфекції, які отримували ВААРТ (ІІІ група). Антитіла класу IgG до ЦМВ були присутні в 77,33±4,83% зразків сироватки крові ВІЛ-інфікованих осіб І дослідної групи, в 78,0±5,86% зразків сироватки крові осіб ІІ групи та в 77,0±2,43% зразків сироватки крові осіб ІІІ групи. Антитіла класу IgG до капсидного білка вірусу Епштейна-Барр було виявлено у всіх (100±0%) осіб з І та ІІ груп та у 99,3±0,48% осіб з ІІІ групи (рис.1).

Для встановлення частоти активації збудників герпесвірусних інфекцій у ВІЛ-інфікованих осіб на наступному етапі роботи було проведено визначення антитіл класу IgM до ВПГ1/2, ЦМВ та капсидного білку ВЕБ в усіх зразках сироватки крові пацієнтів, включених в дослідження. Відомо, що циркуляція специфічних антитіл класу IgM до ВПГ1/2, ЦМВ та капсидного антигену ВЕБ в крові інфікованих осіб свідчить про первинне інфікування і , за умови наявності IgG в сироватці крові, може бути непрямою ознакою активної реплікації вищевказаних збудників на стадії активації інфекційного процесу. Так, при рецидивах ВПГ1/2-інфекції протягом 1-3 неділі в крові хворого з’являються IgM, які швидко зникають. Специфічні IgM до ЦМВ розцінюють, в основному, як маркер первинного інфікування, але у ВІЛ-інфікованих осіб цей серологічний маркер виявляється досить часто при реактивації цитомегаловірусу (Лысенко А.Я. и соавт., 1996).

Антитіла класу IgM до герпесвірусів були виявлені лише у тих пацієнтів, у яких в сироватці крові циркулювали антитіла класу IgG до цих вірусів. Загалом, активація збудників герпесвірусних інфекцій була виявлена у 5,33±2,59% осіб І дослідної групи та у 24,0±6,04% ВІЛ-інфікованих осіб ІІ дослідної групи. Тобто, активація герпесвірусів у пацієнтів, які не отримують ВААРТ, спостерігалася у 4,5 рази частіше при більш вираженому імунодефіциті. Серед ВІЛ-інфікованих осіб в ІІІ-ІV клінічній стадії ВІЛ-інфекції (ІІІ група дослідження), антитіла класу IgМ до герпесвірусів було виявлено у 18,33±2,59% пацієнтів.

У ВІЛ-інфікованих осіб, як тих, що отримують ВААРТ (ІІІ група), так і тих, які не приймають антиретровірусних препаратів (І та ІІ групи), найчастіше виявлялися серологічні маркери активації цитомегаловірусу. Так, у пацієнтів І дослідної групи випадки активації ЦМВ відмічалися в 2,29 разів частіше, ніж випадки активації ВПГ1/2 (р<0,05); у осіб ІІ групи дослідження активація ЦМВ зустрічалася в 2,33 рази частіше, ніж активація ВПГ1/2 та в 3,5 рази частіше, ніж активація ВЕБ. В зразках сироватки крові пацієнтів третьої групи дослідження антитіла класу IgM до цитомегаловірусу виявлялися в 2,43 рази частіше, ніж анти-ВПГ1/2 IgM, та в 3,78 разів частіше, ніж IgM до капсидного білку ВЕБ. Різниця між цими показниками була статистично значимою (р<0,05).

Таким чином, аналіз результатів дослідження щодо виявлення IgM до герпесвірусів показав, що частота активації персистуючих герпесвірусів у пацієнтів, які не отримують ВААРТ, зростає з прогресуванням ВІЛ-інфекції.

Було проведено аналіз частоти виявлення серологічних маркерів герпесвірусних інфекцій у ВІЛ-позитивних осіб в залежності від шляху інфікування ВІЛ. Виявилося, що антитіла класів IgG та IgМ до ЦМВ у осіб з різними шляхами інфікування ВІЛ визначаються з приблизно однаковою частотою, незначна різниця між окремими показниками не була статистично значимою (р>0,05) (табл. 1). Інфікування людини ВПГ-1, ЦМВ та ВЕБ відбувається переважно ще в дитячому віці, тому частота виявлення антитіл класу IgG до герпесвірусів однакова у осіб, інфікованих ВІЛ статевим і парентеральним шляхом. Відомо, що наркотичні речовини володіють імуносупресивною дією (Menzebach A. et al., 2004; Bhat R.S. et al., 2004). У зв’язку з цим, можна було очікувати, що частота активації збудників герпесвірусних інфекцій буде вищою в групі осіб,

Таблиця 1

Частота виявлення серологічних маркерів інфікування ВПГ1/2, ЦМВ та ВЕБ у ВІЛ-інфікованих осіб (в залежності від шляху інфікування ВІЛ)