Хроматографический анализ

Хроматография - это физико-химический метод разделения и анализа смесей газов, паров, жидкостей или растворенных веществ сорбционными методами в динамических условиях. Метод основан на различном распре­делении веществ между двумя несмешивающимися фазами - подвижной и неподвижной.

Подвижной фазой может быть жидкость или газ, неподвижной фазой - твердое вещество, которое называют носителем. При движении подвиж­ной фазы вдоль неподвижной, компоненты смеси сорбируются на непод­вижной фазе. Каждый компонент сорбируется в соответствии со сродством к материалу неподвижной фазы (вследствие адсорбции или других меха­низмов). Поэтому неподвижную фазу называют такжесорбентом. Захва­ченные сорбентом молекулы могут перейти в подвижную фазу и продви­гаться с ней дальше, затем снова сорбироваться.

Таким, образом,хроматографию можно определить как процесс, ос­нованный на многократном повторении актов сорбции и десорбции вещества при перемещении его в потоке подвижной фазы вдоль непод­вижного сорбента. Чем сильнее сродство компонента к неподвижной фа­зе, тем сильнее он сорбируется и дольше задерживается на сорбенте; тем медленнее его продвижение вместе с подвижной фазой. Поскольку компо­ненты смеси обладают разным сродством к сорбенту, при перемещении смеси вдоль сорбента произойдет разделение: одни компоненты задержат­ся в начале пути, другие продвинутся дальше. В хроматографическом про­цессе сочетаются термодинамический (установление равновесия между фазами) и кинетический (движение компонентов с разной скоростью) ас­пекты.

1. История вопроса

Хроматографический метод анализа разработан русским ботаником М.С.Цветом в 1903 г. С помощью этого метода ему удалось разделить хло­рофилл на составляющие окрашенные вещества. При пропускании экс­тракта хлорофилла через колонку, заполненную порошком мела, и промы­вании петролейным эфиром он получил несколько окрашенных зон и на­звал эти зоны хроматограммой (от греческого “хроматос” — цвет), а метод - хроматографией. Н.А.Измайлов и М.С.Шрайбер в 1938 г. разработали новый вид хроматографии, получивший название тонкослойной. Ими были разделены алкалоиды, экстрагированные из лекарственных растений на оксиде алюминия, нанесенном на стекло.

Отправной точкой бурного развития многих методов хроматографического анализа является работа лауреатов Нобелевской премии A.Мартина и Р.Синджа, ими был предложен и разработан метод распределительной хроматографии (1941г.). В 1952 г. А.Мартином и Л.Джеймсом были получены первые результаты в области газожидкостной хроматографии. Эти работы вызвали огромное число исследований, направленных на развитие метода газовой хроматографии.

За короткое время были усовершенствованы конструкции систем ввода проб, созданы чувствительные детекторы. Метод газовой хроматографии - первый из хроматографических методов, получивших инструментальное обеспечение. Начиная с 70-х годов происходит бурное развитие жидкост­ной хроматографии. К настоящему времени разработаны теория хроматографического процесса и множество хроматографических методов анализа.

Среди разнообразных методов анализа хроматография отличается са­мой высокой степенью информативности благодаря одновременной реали­зации функций разделения, идентификации и определения. Кроме того, метод используется и для концентрирования. Хроматографический метод анализа универсален и применим к разнообразным объектам исследования (нефть, лекарственные препараты, вещества растительного и животного происхождения, биологические жидкости, пищевые продукты и др.). Хро­матография отличается высокой избирательностью и низким пределом об­наружения. Эффективность метода повышается при его сочетании с дру­гими методами анализа, автоматизацией и компьютеризацией процесса разделения, обнаружения и количественного определения.

2. Классификация методов хроматографии

Различные методы хроматографии можно классифицировать по агре­гатному состоянию фаз, механизму разделения, аппаратурному оформле­нию процесса (по форме) и по способу перемещения подвижной фазы и хроматографируемой смеси.

По агрегатному состоянию фаз различаютжидкостную и газовую хроматографию.

Разделение веществ протекает по разному механизму, в зависимости от природы сорбента и веществ анализируемой смеси.

По механизму взаимо­действия вещества и сорбента различают сорбционные методы, основан­ные на законах распределения (адсорбционная, распределительная, ионо­обменная хроматография и др.), гельфильтрационные (проникающая хро­матография), основанные на различии в размерах молекул разделяемых веществ. На практике часто реализуются одновременно несколько меха­низмов разделения.

По технике выполнения хроматографию подразделяют на колоночную, когда разделение веществ проводится в специальных ко­лонках, и плоскостную: тонкослойную и бумажную. В тонкослойной хроматографии разделение проводится в тонком слое сорбента, в бумаж­ной - на специальной бумаге.

В зависимости от агрегатного состояния фаз, механизма взаимодейст­вия и оформления различают основные виды хроматографии, которые приведены в табл. 1.

Таблица 1

В соответствии с режимом ввода пробы в хроматографическую систему различаютфронтальную, элюентную и вытеснительную хроматогра­фию. Если растворенную смесь непрерывно вводить в хроматографическую колонку, то в чистом виде можно выделить только одно, наиболее слабо сорбирующееся вещество. Все остальные выйдут из колонки в виде смеси. Этот метод называют фронтальным. В элюентном режиме через ко­лонку пропускают подвижную фазу (элюент), вводят пробу, затем снова пропускают подвижную фазу (ПФ). В процессе движения по колонке компоненты смеси разделяются на зоны. Эти зоны поочередно выходят из колонки, разделенные зонами чистого растворителя.

В вытеснительном методе после введения пробы и предварительного разделения слабоактивным элюентом состав элюента меняется таким обра­зом, что он взаимодействует с неподвижной фазой (НФ) каждого из ком­понентов анализируемой смеси. Вследствие этого новый элюент вытесняет компоненты, которые выходят из колонки в порядке возрастания взаимо­действия с НФ. В этом методе не достигается достаточно полное разделе­ние из-за частичного перекрывания зон.

Наибольшее распространение получил элюентный режим хроматографирования, позволяющий получать в чистом виде все компоненты пробы.

В жидкостной хроматографии применяют изократический и градиент­ный режим подачи элюента. В изократическом режиме состав элюента в течение анализа не изменяется, а в градиентном режиме состав элюента меняется по определенной программе.

Рассмотрим особенности отдельных наиболее широко применяемых видов хроматографии.

3. Жидкостно-адсорбционная хроматография на колонке

Разделение смеси веществ в адсорбционной колонке происходит в ре­зультате различия их в сорбируемости на данном адсорбенте (в соответст­вии с законом адсорбционного замещения, установленного М.С.Цветом).

Адсорбентами являются пористые тела с сильно развитой внутренней поверхностью, удерживающие жидкости с помощью межмолекулярных и поверхностных явлений. Это могут быть полярные и неполярные неорга­нические и органические соединения. К полярным адсорбентам относятся силикагель (высушенная желатинообразная двуокись кремния), оксид алюминия, карбонат кальция, целлюлоза, крахмал и др. Неполярные сор­бенты - активированный уголь, порошок резины и множество других, по­лученных синтетическим путем.

К адсорбентам предъявляют следующие требования:

- они не должны вступать в химические реакции с подвижной фазой и разделяемыми веществами;

- должны обладать механической прочностью;

- зерна адсорбента должны быть одинаковой степени дисперсности.

При выборе условий для хроматографического процесса учитывают свойства адсорбента и адсорбируемых веществ.

В классическом варианте жидкостной колоночной хроматографии (ЖКХ) через хроматографическую колонку, представляющую собой стек­лянную трубку диаметром 0,5 - 5 см и длиной 20 - 100 см, заполненную сорбентом (НФ), пропускают элюент (ПФ). Элюент движется под воздей­ствием силы тяжести. Скорость его движения можно регулировать имею­щимся внизу колонки краном. Анализируемую смесь помещают в верх­нюю часть колонки. По мере продвижения пробы по колонке происходит разделение компонентов. Через определенные промежутки времени отби­рают фракции выделившегося из колонки элюента, который анализируют каким-либо методом, позволяющим измерять концентрации определяемых веществ.

Колоночная адсорбционная хроматография в настоящее время приме­няется, главным образом не как самостоятельный метод анализа, а как спо­соб предварительного (иногда и конечного) разделения сложных смесей на более простые, т.е. для подготовки к анализу другими методами (в том числе и хроматографическими). Например, на колонке с окисью алюминия разделяют смесь токоферолов, пропускают элюент и собирают фракцию a-токоферола для последующего определения фотометрическим методом.

3.1. Высокоэффективная жидкостная хроматография

Хроматографическое разделение смеси на колонке вследствие медлен­ного продвижения ПФ занимает много времени. Для ускорения процесса хроматографирование проводят под давлением. Этот метод называют вы­сокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЖХ)

Модернизация аппаратуры, применяемой в классической жидкостной колоночной хроматографии, сделала ее одним из перспективных и совре­менных методов анализа. Высокоэффективная жидкостная хроматография является удобным способом разделения, препаративного выделения и про­ведения качественного и количественного анализа нелетучих термола­бильных соединений как с малой, так с большой молекулярной массой.

В зависимости от типа применяемого сорбента в данном методе ис­пользуют 2 варианта хроматографирования: на полярном сорбенте с ис­пользованием неполярного элюента (вариант прямой фазы) и на неполяр­ном сорбенте с использованием полярного элюента - так называемая обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОфВЖХ).

При переходе элюента к элюенту равновесие в условиях ОфВЖХ уста­навливается во много раз быстрее, чем в условиях полярных сорбентов и неводных ПФ. Вследствие этого, а также удобства работы с водными и водно-спиртовыми элюентами, ОфВЖХ получила в настоящее время большую популярность. Большинство анализов при помощи ВЖХ прово­дят именно этим методом.

Аппаратура для ВЖХ

Комплект современного оборудования для ВЖХ, как правило, состоит из двух насосов 3, 4 (рис.3.1.1), управляемых микропроцессором 5, и по дающих элюент по определенной программе. Насосы создают давление до 40 МПа. Проба вводится через специальное устройство (инжектор) 7 непо­средственно в поток элюента. После прохождения через хроматографиче­скую колонку 8 вещества детектируются высокочувствительным проточ­ным детектором 9, сигнал которого регистрируется и обрабатывается мик­ро-ЭВМ 11. При необходимости, в момент выхода пика автоматически от­бираются фракции.

Рис. 3.1.1. Схема современного жидкостного хроматографа

1,2 - сосуды с элюентами; 3, 4 - насосы; 5 контроллер;

6 - смесительная камера; 7 - инжектор; 8 - колонка; 9 - детектор;

10 - регистратор; 11 - блок автоматической обработки результатов анализа; 12 — коллектор фракций; 13- термостат

Колонки для ВЖХ выполняют из нержавеющей стали с внутренним диаметром 2-6 мм и длиной 10-25 см. Колонки заполняют сорбентом (НФ). В качестве НФ используются силикагель, оксид алюминия или мо­дифицированные сорбенты. Модифицируют обычно силикагель, внедряя химическим путем в его поверхность различные функциональные группы.

Детекторы. Регистрация выхода из колонки отдельного компонента производится с помощью детектора. Для регистрации можно использовать изменение любого аналитического сигнала, идущего от подвижной фазы и связанного с природой и количеством компонента смеси. В жидкостной хроматографии используют такие аналитические сигналы, как светопоглощение или светоиспускание выходящего раствора (фотометрические и флуориметрические детекторы), показатель преломления (рефрактометри­ческие детекторы), потенциал и электрическая проводимость (электрохи­мические детекторы) и др.

Непрерывно детектируемый сигнал регистрируется самописцем. Хроматограмма представляет собой зафиксированную на ленте самописца по­следовательность сигналов детектора, вырабатываемых при выходе из ко­лонки отдельных компонентов смеси. В случае разделения смеси на внеш­ней хроматограмме видны отдельные пики. Положение пика на хроматограмме используют для целей идентификации вещества, высоту или пло­щадь пика - для целей количественного определения.

Качественный анализ

Рис.3.1.2. Параметры хроматограммы

Важнейшие характеристики хроматограммы - время удерживания t_rи связанный с ней удерживаемый объем — отражают природу веществ, их способность к сорбции на материале неподвижной фазы и, следовательно, при постоянстве условий хроматографирования являются средством иден­тификации вещества. Для дан­ной колонки с определенными скоростью потока и температу­рой время удерживания каждо­го соединения постоянно (рис), где t_R(a) - время удерживания компонента А анализируемой смеси с момента ввода в колонку до появления на выходе из колонки максиму­ма пика, t_R(BC) - время удерживания внутреннего стандарта (первоначально отсутствующее в анализируемой смеси вещество), h - высота пика (мм), a_1/2 — ширина пика на половине его высоты, мм.

Для идентификации вещества по хроматограмме обычно используют стандартные образцы или чистые вещества. Сравнивают время удержива­ния неизвестного компонента t_Rx с временем удерживания t_RCT известных веществ. Но более надежна идентификация по измерению относительного времени удерживания

t_R(A)

t_R(отн)= ____ (3.1.1).

t_R(BC)

При этом в колонку сначала вводят известное вещество (внутренний стандарт) и измеряют время его удерживания t_R(BC), затем хроматографически разделяют (хроматографируют) исследуемую смесь, в которую пред­варительно добавляют внутренний стандарт. Относительное время удер­живания определяют по формуле (3.1.1).

Количественный анализ

В основе этого анализа лежит зависимость высоты пика h или его пло­щади S от количества вещества. Для узких пиков предпочтительнее изме­рение h, для широких размытых - S. Площадь пика измеряют разными способами: умножением высоты пика (h) на его ширину (а_1/2), измеренную на половине его высоты (рис 3.2.3); планиметрированием; с помощью ин­тегратора. Электрическими или электронными интеграторами снабжены современные хроматографы.

Для определения содержания веществ в пробе используют в основном три метода: метод абсолютной градуировки, метод внутренней нормализа­ции и метод внутреннего стандарта.

Метод абсолютной градуировки основан на предварительном опреде­лении зависимости между количеством введенного вещества и площадью или высотой пика на хроматограмме. В хроматограмму вводят известное количество градуировочной смеси и определяют площади или высота по­лученных пиков. Строят график зависимости площади или высоты пика от количества введенного вещества. Анализируют исследуемый образец, из­меряют площадь или высоту пика определяемого компонента и на основа­нии градировочного графика рассчитывают его количество.

Метод внутренней нормализации основан на приведении к 100% суммы площадей всех пиков на хроматограмме. Расчет массовой доли в % одного компонента проводят по формуле

K_AS_A

w_(a)% =________________ , (3.1.2)

K_AS_a+K_bS_b+...K₂S_i

где К - поправочные коэффициенты, s_a, s_b, S_i - площади пиков компонен­тов смеси.

Этот метод дает информацию только об относительном содержании компонента в смеси, но не позволяет определить его абсолютную величи­ну.

Метод внутреннего стандарта основан на сравнении выбранного па­раметра пика анализируемого вещества с тем же параметром стандартного вещества, введенного в пробу в известном количестве. В исследуемую пробу вводят известное количество такого стандартного вещества, пик ко­торого достаточно хорошо отделяется от пиков компонентов исследуемой смеси (рис. 3.2.3). Проводят анализ пробы с внутренним стандартом и рас­считывают количество определяемого вещества по формуле

k_(a)h_(a)

g_(а)= ___________g_(BC) (3.1.3)

K_(BC)h_(BC)

где g_(A) - количество определяемого компонента А; h_(A) - высота пика ком­понента A; g_(BC)- количество внутреннего стандарта; h_(BC) - высота пика внутреннего стандарта; к_(A) и k_(BC)- поправочные коэффициенты.

В последних двух методах требуется введение поправочных коэффици­ентов, характеризующих чувствительность используемых детекторов к анализируемым веществам. Для разных типов детекторов и разных ве­ществ коэффициент чувствительности определяется экспериментально.

В жидкостной адсорбционной хроматографии используется также ана­лиз фракций растворов, собранных в момент выхода вещества из колонки. Анализ может быть проведен различными физико-химическими методами.

Жидкостную адсорбционную хроматографию применяют в первую очередь для разделения органических веществ. Этим методом весьма ус­пешно изучают состав нефти, углеводородов, эффективно разделяют - транс- и цис- изомеры, алкалоиды и др. С помощью ВЖХ можно опреде­лять красители, органические кислоты, аминокислоты, сахара, примеси пестицидов и гербицидов, лекарственных веществ и других загрязнителей в пищевых продуктах.

3.2. Ионообменная хроматография

Ионообменная хроматография (ИХ) является разновидностью жидко­стной хроматографии и в аппаратурном оформлении ничем не отличается от других видов жидкостной колоночной хроматографии. В основе ионо­обменной хроматографии лежит процесс обмена между ионами анализи­руемого раствора (ПФ) и подвижными ионами того же знака ионообменника (НФ).

В качестве ионообменников или ионитов обычно используют синтети­ческие полимерные вещества, называемые ионообменными смолами. Они состоят из матрицы (R) и активных групп, содержащих подвижные ионы. В зависимости от знака обмениваемых ионов различают катиониты и аниониты. Катиониты содержат кислотные группы различной силы, такие как сульфогруппы, карбоксильные, оксифенильные. Аниониты имеют в своем составе основные группы, например алифатические или ароматиче­ские аминогруппы различной степени замещенности (вплоть до четвер­тичных).

Иониты могут находиться в Н-форме и ОН - форме, а также в солевой форме. В Н-форме катиониты и ОН- форме аниониты содержат способные к обмену ионы водорода и гидроксила соответственно, в солевых формах ионы водорода заменены катионами металла, анионы гидроксила - анио­нами кислот.

В зависимости от силы кислотных и основных групп в ионитах разли­чают сильнокислотные (R-SOзН) и слабокислотные (R-СООН) катиони­ты; сильноосновные (R-N(СНз)зОН) и слабоосновные (R-NНзОН).

Сильнокислотные и сильноосновные иониты способны к ионному об­мену в широком диапазоне рН.

Процесс ионного обмена протекает стехиометрично. Например:

R-SO₃H+Na⁺=RSO₃Na+H⁺

R(NНз)зОН+Сl^-=R(NНз)зСl+ОН^-

Это ионообменное равновесие характеризуется константой ионного обмена:

(H⁺)(RSO₃Na) (OH^-)(RN(CH₃)₃Cl

K_H+_/Na+=______________; K_OH^-_/Cl^-= _________________

(Na⁺)(RSO₃H) (Cl^-)(RN(CN₃)₃OH)

На основании констант ионного обмена построены ряды сродства ио­нов к данному иониту, позволяющие предвидеть возможности ионообмен­ных разделений.

В зависимости от сродства к фиксированным ионам неподвижной фазы разделяемые ионы перемещаются вдоль хроматографической колонки с различными скоростями; чем выше сродство, тем больше объем удержива­ния компонента. При разделении органических кислот и оснований важ­ную роль играет степень их диссоциации.

Для двух веществ, имеющих разные константы обмене, рассчитывают фактор разделения или коэффициент распределения, который характеризу­ет селективность ионита

K_A

f_a/b= ___ , (3.2.1)

K_B

где f_a/b - фактор разделения; K_A; K_B - константы ионного обмена веществ А и В. Чем больше фактор разделения, тем сильнее ионит удерживает ве­щество А.

Например, константы ионного обмена солей железа (III) и кобальта (II) на сильнокислотном катионите марки КУ-2 составляют 3726 и 286 соответственно.

3726

Тогда согласно формуле 7.2.1 получим: F_Fe³/_Co²⁺ = ____=13.

286

Таким образом, можно сделать вывод, что катионит КУ-2 более селективен к ионам железа (III).

Важной количественной характеристикой ионитов является их обменная емкость. Полная обменная емкость определяется количеством эквива­лентов ионов, обмениваемых одним граммом сухого ионита. Чем больше обменная емкость, тем большую пробу можно ввести в колонку с ионитом.

При подготовке ионитов к работе их переводят в соответствующую форму. Так, для перевода катионита в Н-форму через колонку с набухшим ионитом пропускают раствор сильной кислоты, избыток которой отмыва­ют водой. Затем медленно пропускают раствор смеси ионов. Каждый ка­тион задерживается на ионите согласно своей сорбируемости. Далее про­пускают подходящий элюент. Например, катионы щелочных металлов легко элюируются 0,1 М HCl. При этом ионы водорода обмениваются на сорбированные катионы, которые вместе с раствором выходят из колонки в соответствии с константами ионного обмена. На выходе из колонки фракции собирают в отдельные сосуды и определяют содержание любым подходящим методом.

Иониты применяются для деионизации (обессоливания) воды, очистки сахарных сиропов от минеральных солей; в препаративной химии - для концентрирования растворов; для определения ионов железа (III), меди и свинца в вине; кальция и магния в молоке; различных металлов в биологи­ческих жидкостях. Кроме того, ионный обмен используют для перевода ионов в форму, удобную для количественного определения. Например, поваренную соль в рассоле можно определить, пропустив пробу через колон­ку с катионитом, и выделившуюся в эквивалентном количестве кислоту оттитровать щелочью:

R-SOзН+NaCI=R-SOзNa+НСl.

Ионообменную хроматографию применяют для разделения фенолов, карбоновых кислот, аминосахаров, пуриновых, пиримидиновых и других оснований. Часто иониты используют для предварительного разделения сложных смесей на менее сложные. На ионном обмене основано получе­ние ионитного молока для детского питания. Ионный обмен используют для очистки натуральных соков от ионов тяжелых металлов. Ионообмен­ные смолы применяют для получения ионообменных мембран.

3.3. Тонкослойная хроматография

Тонкослойная хроматография (ТСХ) является одним из наиболее про­стых и эффективных экспресс-методов разделения и анализа веществ в пищевых продуктах, биологических жидкостях и других объектах, не тре­бующих сложного оборудования. В то же время метод обладает высокой избирательностью и чувствительностью (низким пределом обнаружения). Этим методом можно определить 10-20 мкг вещества с точностью до 5-7%.

В зависимости от природы НФ тонкослойная хроматография может быть адсорбционной и распределительной. Наиболее широко применим в ТСХ первый вариант разделения.

Неподвижная твердая фаза (оксид алюминия, силикагель и др.) тонким слоем наносится на стеклянную, металлическую (алюминиевая фольга) или пластмассовую пластинку, закрепляется слой с помощью крахмала или гипса (иногда используют пластинки с незакрепленным слоем). Для хроматографирования могут использоваться готовые пластинки, выпускае­мые промышленностью, размером 5х15 или 20х20 см.

На расстоянии 2 см от края пластинки на стартовую линию с помощью микропипетки или микрошприца наносят пробы анализируемого раствора (диаметр пятен 3-5 мм). После испарения растворителя край пластинки помещают в стеклянную камеру, на дно которой налит растворитель (ПФ) в количестве, достаточном для образования слоя глубиной 0,5 см. Камеру закрывают крышкой.

Выбор растворителя (ПФ) зависит от природы сорбента и свойств ана­лизируемых соединений. Например, разделение хлорорганических пести­цидов на пластинке с силикагелем проводят в среде гексана. Часто приме­няют смеси растворителей из двух или трех компонентов. Так, при хроматографировании аминокислот используют смесь Н-бутанола с уксусной кислотой и водой, при анализе неорганических ионов - водные буферные растворы, создающие постоянное значение рН.

При хроматографировании растворитель движется снизу вверх (восхо­дящий вариант) вдоль слоя сорбента и с разной скоростью переносит ком­поненты смеси, что приводит к их пространственному разделению. После окончания хроматографического процесса пластинку вынимают из каме­ры, отмечают линию фронта растворителя (обычно около 10 см) и высушива­ют.

Если компоненты смеси окрашены, то они четко видны на пластине по­сле разделения. Неокрашенные соединения обнаруживают различными способами. Если пластину поместить в камеру с парами йода, то четко проявляются коричневые пятна для органических соединений с непредельными связями. Хроматограмму можно проявить, опрыскивая ее каким-либо реагентом, дающим с компонентами пробы окрашенные соеди­нения. В состав нанесенного слоя в готовые пластины часто вводят люми­нофор. При облучении такой пластины ультрафиолетовым (УФ) светом она флуоресцирует, а разделенные компоненты пробы видны в виде тем­ных пятен. Вещества, имеющие собственную флуоресценцию, также обна­руживают в УФ - свете (например, пестициды).

Идентификацию веществ на хроматограмме осуществляют по характе­ру окраски пятен, параметру удерживания R_f и с помощью стандартных веществ (свидетелей).

Величина R_f рассчитывается из экспериментальных данных по уравнению

l

R_f=__ , (3.3.1)

L

где l - расстояние от стартовойлинии до центра пятна, L - расстояние, пройденное за это же время растворителем (рис. 3.3.1).

Рис. 3.3.1. Хроматограмма двухкомпонентной смеси

а - а: линия старта, в - в : линия фронта растворителя

При стандартных условиях величина R_f является постоянной величиной, характер­ной для данного соединения. Но практика показывает, насколько трудно создавать постоянство всех факторов, от которых зависит воспроизводи­мость значений R_f. На величину R_f влияет качество и активность сорбента, его влажность, толщина слоя, качество растворителей и другие факторы, не всегда поддающиеся достаточному контролю.

Рис. 3.3.2. Хроматограмма жира. I - полимеризованные и сильнополярные жиры; II - фосфолипиды, III – триглицериды 1 - говяжье мясо; 2 - свинина; 3 - свинина с 29% печени; 4 - свинина с 4% печени; 5 - свинина с 50% печени; 6 - свиная печень

Поэтому наряду с величиной R_f идентификацию проводят по “свидетелю”. Стандартное вещество (свидетель), наличие которого предполагают в анализируемой смеси, наносят на линию стандарта рядом с исследуемой пробой. Таким образом, стандартное вещество хроматографируется в тех же условиях. После хроматографирования и детекции пятен сравнивают величины R_f определяемого вещества и “свидетеля”.

Качественный анализ после разделения компонентов смеси методом ТСХ часто используют для определения состава пищевых продуктов. Так, на рис. 3.3.2 представлена хроматограмма жира, выделенного из мясного фарша различного состава. Хроматографирование проводили на пластинках с силикагелем в системе гександиэтиловый эфир (в соотноше­нии 3:1), пятна детектировали 10% раствором фосфорно-молибденовой кислоты, идентифицировали по голубому цвету зон на жел­том фоне пластинки. Как видно из хроматограммы, при данных условиях произошло разделение фосфолипидов и триглицеридов. По характерному составу компонентов мяса и печени можно сделать вывод о натуральности мясного фарша в пробах 1-2, и добавках к нему печени в пробах 3-5.

Количественное определение в ТХС может быть проведено непосред­ственно на пластинке, иди после удаления веществ с пластинки. При непо­средственном определении на пластинке измеряют тем или иным способом площадь пятна (например, с помощью миллиметровой кальки) и по зара­нее построенному градуировочному графику находят количество вещест­ва. Зависимость между массой вещества q и площадью S на хроматограммах носит нелинейный характер и является логарифмической:

S=a lg q + в, (3.3.2)

где а и в эмпирические константы. Эта зависимость линейна для количеств вещества от 1 до 80-100 мкг.

Рис. 3.3.3. Зависимость площади пятен на хроматограмме от количества вещества: а - хроматограмма, б – калибровочный график

Для построения градуировочного графика на пластинку наносят растворы, содержащие разные количества стандартного вещества, хроматографируют, проявляют зоны и измеряют их площади (рис. 3.3.3).

Более точен денситометрический метод определения веществ на хроматограммах (ошибка - 1-2%). В методе денситометрии производят измере­ние оптического поглощения проявленной хроматограммы сканирующим лучом в проходящем или отраженном свете на специальных приборах-денситометрах (рис.3.3.4.).

Рис. 3.3.4. Схема денситометра. 1 – протяжный механизм; 2 – источник света; 3 – хроматограмма, 4 – фотоэлектрический преобразователь, 5 – усилитель, 6 – самописец.

На денситограмме получают пики, площадь которых пропорциональна содержанию вещества в пятне. Построив с помощью стандартов калибровочный график, измеряют площадь пика компонента и по графику определяют его массу в пробе. Получают развитие также спектрофотоденситометрическое и флуориметрическое определение ве­ществ на хроматограммах.

В первом случае используют специальные спектрофотоденситометры, измеряющие поглощение вещества в монохроматическом свете, во втором измеряют флюоресценцию пятна при облучении хроматограммы УФ све­том. Широкое распространение получил способ экстрагирования компо­нентов из зон подходящим растворителем. При применении этого способа на хроматограмму наносят стандартный раствор и раствор пробы. После получения хроматограммы производят ее обработку, детектируя зону стандарта, вырезают часть хроматограммы с зоной компонента пробы и производят его экстрагирование подходящим растворителем. Полученный раствор анализируют инструментальным методом, имеющим высокую чувствительность. Чаще всего применяют спектрофотометрические и фо­токолориметрические методы. Если вещество не имеет цвета или не обла­дает поглощением в УФ-области, с экстрактом проводят фотометрическую реакцию, позволяющую получить интенсивно поглощающее производное вещества.

Тонкослойная хроматография находит применение при исследовании некоторых видов пищевых продуктов на безопасность. Например, для оп­ределения токсинов (афлатоксинов, микотоксинов, патулина и др.) в ара­хисе, в зерновых, овощах, фруктах, напитках; для определения пестицидов (ДДТ и др.) в растительных и животных продуктах, определения гистамина как показателя порчи рыбы. Кроме того, ТСХ часто сочетают с газовой хроматографией, электрофорезом и другими методами.

3.4. Хроматография на бумаге

По механизму разделения различают распределительную, адсорбцион­ную, осадочную и другие виды бумажной хроматографии (БХ). В распре­делительной жидкость-жидкостной хроматографии бумага, приготовлен­ная из специальных сортов хлопка, выполняет роль носителя неподвижной жидкой фазы (НФ), в качестве которой часто выступает вода, адсорбиро­ванная парами бумаги. В таком случае гидрофильная бумага используется для нормально-фазовой хроматографии.

Растворителями (ПФ) являются спирты (метанол, этанол, н-пропанол, бутанол), простые эфиры (этиловый, метиловый), кетоны (ацетон, ацетил-ацетон), эфиры органических кислот (метилацетат, этилацетат), пиридин, хлороформ. Чаще используются смеси растворителей. Так, для разделения неорганических неполярных веществ употребляют системы:

- ацетон: НCl: Н₂О (в различных соотношениях);

- Н-бутанол, насыщенный НСl (различной концентрации);

- Н-бутанол: 0,1М НNОз - ацетилацетон.

Для разделения некоторых органических веществ используют метод обращенных фаз. В этом методе для придания бумаге гидрофобного харак­тера ее импрегнируют (пропитывают) нафталином, парафином, раствором каучука, силиконом и др. Такая бумага служит носителем для неполярных растворителей в качестве НФ. В качестве ПФ применяют смеси кислот с низшими спиртами.

Обращеннофазовая бумажная хроматография использу­ется, например, для разделения и идентификации полинасы­щенных жирных кислот при изучении состава липидов, вы­деленных из животных тканей. Бумагу пропитывают 5% рас­твором силикона, в качестве ПФ используют 85% раствор уксусной кислоты.

Рис.3.4.1. Виды бумажной хроматографии

Разделение веществ в распределительной БХ осуществляется благодаря различию в скоростях движения компонентов при многократном повторе­нии актов экстракции и сорбции. Скорость перемещения компонентов за­висит от их коэффициентов распределения (как и в методе экстракции).

По направлению движения элюента (ПФ) различают восходящую, нис­ходящую и радиальную (круговую) хроматографию.

Если элюент движется по бумаге вверх, метод называют восходящей (а) бумажной хроматографией; при его движении сверху вниз - нисходя­щей (б) бумажной хроматографией. Очень быстро можно осуществить хроматографический анализ методом радиальной (в) бумажной хромато­графии, в котором используется бумажный круг (г) с фитилем, опущен­ным в элюент. (рис. 3.4.1)

Иногда при сложном составе пробы не удается разделить ее компонен­ты с помощью одного растворителя. Тогда применяют двумерную хрома­тографию. В угол квадратного листа хроматографической бумаги наносят хроматографической бумаги наносят раствор пробы и хроматографируют сначала в одном элюенте, затем, по­вернув хроматограмму на 90, - в другом. Первый элюент производит предварительное разделение компо­нентов пробы, второй окончатель­ное (рис.3.4.2).

Рис.3.4.2. Двухмерная хроматография

Для проведе